原发性醛固酮增多症(PA)是继发性高血压的一种常见形式，已被证明与心血管和肾脏疾病的风险增加有关。类固醇激素醛固酮的过度产生导致肾小管中NaCl转运蛋白的活性增加，从而增加体液量和血压(BP)。实验证据表明，顶端膜通道和转运蛋白，如上皮Na+通道(ENaC)、Na-Cl-协同转运蛋白(NCC)和Cl-/HCO3-交换器pendrin在醛固酮过量的情况下失调。然而，很少有研究检验动物模型中报告的机制是否适用于人类的PA。
Pendrin是一种Cl-/HCO3-交换剂，选择性地存在于肾脏的闰细胞(intercalated cells)中。尽管实验研究表明，pendrin调节肾素-血管紧张素-醛固酮（RAA）系统下游的血压，但其在人类高血压中的作用仍不清楚。日本东京帝京大学医学院内科肾脏科Fumika Ochiai-Homma等发表在Hypertension Research上的一项研究分析了从原发性醛固酮增多症 (PA) 患者和醛固酮过量大鼠模型中分离出的尿液细胞外囊泡 (uEVs) 中pendrin的定量变化。
研究背景和目的
Pendrin由SLC26A4编码，选择性存在于肾脏的β-闰(β-intercalated)细胞和非α、非β闰细胞中，介导Cl-重吸收以交换HCO3-分泌。使用动物模型的实验研究证明了pendrin在调节血压方面的重要性。已显示缺乏pendrin的小鼠在对NaCl限制后血压降低，并且未能对盐皮质激素表现出升压反应(a pressor response)。相反，过度表达pendrin的转基因小鼠表现出盐依赖性高血压。此外，缺乏pendrin和NCC的双基因敲除小鼠表现出严重的盐分消耗和体积消耗(volume depletion)，证实了这些蛋白质在体液体积稳态中的补偿作用。作为上游信号组分，pendrin受多种机制调节，包括RAA系统、酸/碱变化以及钾和氯平衡。
在体积消耗(volume depletion)中，pendrin受到血管紧张素II (AngII)和盐皮质激素受体(MR)的刺激，既往已经报道了AngII和MR之间的信号相互作用，其中AngII通过涉及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin)和 unc-51样激酶 1(unc51-like kinase 1)机制在S843处使MR去磷酸化，促进MR 信号传导和pendrin诱导。关于pendrin在人类血压调节中的作用，一项研究调查了双等位基因SLC26A4突变受试者的血压水平。在这项研究中，作者发现与年龄匹配的对照组相比，这些患者的收缩压和舒张压均降低了4~6 mm Hg。尽管如此，关于pendrin在人类血压调节中的作用的证据仍然有限。
在真核细胞中，包括外泌体在内的纳米级细胞外囊泡 (EVs) 从多泡体释放到细胞外液中，包括血浆和尿液。这些颗粒携带存在于其起源细胞中的蛋白质，表明它们可能作为疾病风险和进展的生物标志物。在人类尿液中，外泌体已通过差速离心(differential centrifugation)的方法成功鉴定，并且有几项研究调查了它们在健康和疾病状态下的生物学重要性。
一项对健康个体尿液EVs的大规模蛋白质组学研究检测到许多盐和水转运蛋白，包括pendrin。另一项蛋白质组学研究分析了原发性高血压患者对高盐或低盐饮食的反应的急性变化，并报告说限制盐分会增加pendrin肽，这一发现与动物模型中的观察结果一致。在健康个体中也报道了响应于NaCl、NH4Cl和NaHCO3负载的uEVs中pendrin丰度的变化。基于这些观察，该项研究旨在确定在基线和治疗期间从PA患者尿液中分离出的EVs中pendrin水平的变化。研究还使用PA的动物模型测试了pendrin在uEVs中的生物学重要性。
研究方法
这项观察性研究共包括30例在Yokohama Rosai医院或其他医院诊断为PA的患者。所有病例均通过基线促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质醇水平以及地塞米松抑制试验排除库欣综合征。在第一组研究中，收集13例PA患者在基线检查时(无MR拮抗剂治疗)和随访时(药物或手术治疗后至少3个月)的现场尿液(spot urine)，以分离uEVs。比较每个参与者在治疗前后uEVs中pendrin水平的变化。在第二组研究中，从28例未使用MR拮抗剂的PA患者(其中11例患者也参与了第一组研究)中收集了现场尿液，并分析了uEVs中pendrin水平与生化参数的相关性。根据先前的报告，研究对人类uEVs进行了分离。动物实验中，六周龄雄性Sprague-Dawley大鼠来自东京实验动物科学。大鼠在单肾切除术(Aldo组)后，通过微型泵以0.75μg/h的剂量持续输注醛固酮。醛固酮的剂量与研究者之前的实验一致。一组注射醛固酮的大鼠接受非甾体类MR拮抗剂esaxerenone[混合(mixed in chow)，0.001%；相当于1 mg/kg体重/天；Aldo+Esax]。对照组大鼠进行假手术(a sham operation )(确认假手术组大鼠和接受持续输注溶媒的未切除肾的大鼠之间的pendrin水平相似)。在整个实验过程中，所有大鼠均接受含有0.3% NaCl的标准食物。
研究对uEVs做电镜观察，进行蛋白质印迹和肽竞争试验(Peptide competition assay)以及免疫荧光研究。统计学上，两组间比较采用非配对t检验。对于多重比较，采用方差分析进行统计分析，然后进行Tukey事后检验。配对t检验用于评估pendrin水平随时间的变化。参数之间的相关性通过Pearson相关检验进行分析。在相关分析之前，对ARR、血浆醛固酮、PRA和尿Na+/K+进行对数变换。
研究主要结果
PA患者尿液EVs中pendrin单体和二聚体的检测
我们首先描述了与PA患者分离的uEVs中的pendrin信号，如图1A所示，样品的电子显微镜分析证实了外泌体样颗粒(大小为20~100 nm)富集，从而验证了样品质量。使用抗pendrin抗体对uEVs进行Western blot分析显示，在~120 kDa和~240 kDa处有两条免疫反应带，分别代表单体和二聚体形式(图1B)。通过与免疫pendrin肽竞争，这两种信号被完全消除(图1B)，证实pendrin在uEVs中表现出二聚体结构。在下面的分析中，两种形式都包括在内以确定uEVs中的pendrin丰度。
图1. 检测从原发性醛固酮增多症患者分离出的尿液细胞外囊泡中的pendrin
在PA啮齿动物模型中尿液EVs中pendrin水平与肾脏pendrin丰度的相关性
尽管uEVs被认为是各种肾脏疾病的有用生物标志物，但其在肾脏生物学中的相关性尚不清楚。接下来，研究者使用醛固酮过量的大鼠模型测试了pendrin在尿EVs中的生理重要性。Sprague-Dawley大鼠在单肾切除术(unine- phrectomy)后持续输注醛固酮。一组注射醛固酮的大鼠同时接受一种MR拮抗剂esaxerenone。4周后，测定肾脏和uEVs中的pendrin水平。正如之前在类似模型中所报告的，在注射醛固酮的大鼠中，在水通道蛋白-2-阴性闰细胞(aquaporin-2-negative intercalated cells)的顶膜高度检测到pendrin(图2A)。然而，注射醛固酮的大鼠接受esaxerenone后的pendrin信号与对照组动物的pendrin信号相似(图2A)。Western blot分析证实，醛固酮显著增加肾脏中的pendrin丰度(增加2.1倍)，几乎完全可被esaxerenone阻断(图2B)。
然后，研究者分析了uEVs中pendrin水平(校正Alix)与肾脏中pendrin水平(校正CBB密度)的相关性。与人类尿液样本的结果一致，在大鼠uEVs中检测到二聚体形式的pendrin约为240 kDa，单体形式的pendrin约为120 kDa(图2C)。通过免疫pendrin肽预孵育再次完全消除这些信号(图2C)。约300 kDa的额外条带未被阻断肽消除，表明该条带包含非特异性信号。
研究者量化了uEVs中pendrin的丰度，并将其水平与肾脏pendrin水平进行比较。相关分析显示，uEVs中pendrin水平与肾脏中pendrin丰度高度相关(R2=0.500；P=0.0069)(图2D和E)，证实Western blot分析的uEVs中的pendrin可以预测醛固酮过量时肾脏中pendrin丰度的水平。
图2. 分析注射醛固酮的大鼠和接受非甾体盐皮质激素受体(MR)拮抗剂esaxerenone的大鼠肾脏和uEVs中的pendrin丰度
先前的研究记录了服用盐皮质激素后uEVs中ENaC和NCC水平的急性变化。研究还评估了在接受慢性醛固酮输注加或不加esaxerenone的大鼠模型中，uEVs中的ENaC和NCC水平是否与肾脏水平相关。与pendrin的结果类似，研究发现uEVs中cleaved ENaCγ和NCC水平与肾脏中的水平显著相关(图3)。这些数据与先前的研究一致，进一步证实了uEVs分析的有用性。
图3. 醛固酮注射大鼠和esaxerenone治疗大鼠uEVs中NCC和ENaC的分析
PA患者治疗后尿液EVs中pendrin的减少
研究者检查了PA患者的uEVs中的pendrin水平是否因治疗而改变。13例患者在治疗前后(单侧肾上腺切除术和药物MR阻断)通过Western blot分析uEVs中的pendrin水平。如图4A和图4B所示，治疗后患有PA的受试者的pendrin丰度较基线显著降低(减少49%；P<0.001)。先前的一项研究表明，MR拮抗剂和肾上腺切除术对PA患者同样有效。研究一致发现，在接受肾上腺切除术的患者和未经手术干预而接受MR拮抗剂治疗的患者之间，pendrin复位的影响程度没有显著差异。与基线水平相比，两组的pendrin水平均显著降低，尽管后一组的影响更为多变(图4C)。
图4. 从PA受试者分离的尿液EV中pendrin的治疗前后分析
为了深入了解与pendrin丰度降低相关的因素，研究使用基线时获得的几个临床参数进行了相关分析。发现治疗后pendrin下降的幅度与基线时的对数转化(log- transformed)的醛固酮/肾素比值(ARR)显著相关(R2=0.376；P=0.026)(图5A)。如图5B和图5C所示，血清醛固酮水平和血浆肾素活性(PRA)之间没有显著相关性。缺乏与血清醛固酮水平的显著相关性可能与其高变异性以及当前研究中受试样本数量有限有关。
现有证据表明，pendrin在体液量稳态、钾平衡和酸碱调节中起着关键作用。接下来，研究分析了pendrin水平与血清K+和BP水平的相关性。pendrin水平与基线血清K+水平呈负相关(R2=0.249；P=0.082；图5D)。然而，研究发现pendrin下降与收缩压之间没有显著相关性(图5E)，这可以通过大多数患者服用抗高血压药物来控制血压这一事实来解释。由于大多数研究参与者的血清碳酸氢盐水平不可用，研究使用了血清[Na+]-[Cl−]差异作为PA中血清碳酸氢盐水平替代估计值(该值与研究的大鼠PA模型中的血清碳酸氢盐水平密切相关)。如图5F所示，pendrin减少与血清[Na+]-[Cl−]之间没有显著相关性差别。
图5. 治疗后pendrin水平变化与基线醛固酮肾素比率(ARR)(A)、血清醛固酮(B)、血浆肾素活性(PRA)(C)、血清K+(D)、收缩压(BP)(E)和血清[Na+]-[Cl−]之间的关系差异(F)
PA患者尿液EVs中pendrin与ARR的相关性
为了验证pendrin和ARR之间的相关性，研究最终评估了28例未接受MR拮抗剂或肾上腺切除术的PA患者在样本收集时uEVs中的pendrin丰度与ARR之间的关联。相关分析显示，针对Alix校正的pendrin丰度与ARR显著相关(R2=0.193；P=0.019)(图6A)，证实了上述研究中观察到的关系。此外，类似于先前详细分析来自高血压受试者的uEVs中ENaC的研究，研究者发现uEVs 中的 pendrin丰度与PA患者的尿Na+/K+比值显著相关(R2= 0.244；P=0.008)。
图6. 未接受肾上腺切除术或MR拮抗剂治疗的PA患者尿液EVs中pendrin丰度与ARR(A)和尿Na+/K+(B)的相关性分析
研究结论
该项研究证明，在醛固酮过量大鼠模型中，在uEVs中检测到pendrin以二聚体和单体形式存在，这与肾脏pendrin丰度相关。研究还发现，在PA患者中，通过肾上腺切除术或药物MR阻断，uEVs中的pendrin水平显著降低；治疗前的变化幅度与ARR相关。最后，横截面分析显示，uEVs中的pendrin水平与ARR显著相关。这些数据与实验研究一致，实验研究显示在醛固酮过量状态下pendrin受到刺激，表明其在醛固酮诱导的体液和电解质异常中的作用。在人类PA的治疗中pendrin丰度是减弱的，uEVs中pendrin和其他蛋白的分析有助于理解高血压的病理生理学。
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