孟德尔随机分析等研究表明，循环脂蛋白（a）[Lp（a）]水平升高与冠心病（CAD）、缺血性卒中和钙化性主动脉瓣狭窄等心血管疾病（CVD）有关。最近数据显示，即使控制低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，Lp（a）升高仍是CVD的独立危险因素。血管钙化在CVD中普遍存在，是心血管事件强有力的预测因素，尤其是在CAD患者中。然而Lp（a）与血管钙化的关系仍不清楚。血管钙化以钙盐在动脉壁内膜特别是血管平滑肌细胞的病理性沉积为特征，冠脉壁中磷酸钙晶体形成主要与动脉粥样硬化的发生有关。冠脉钙化常见于CAD患者，可通过冠脉CT检测。此前研究表明，冠脉钙化与CAD有关，在动脉粥样硬化斑块形成中起多种作用。此外，冠脉钙化及其进展被视为心血管事件的危险因素。因此，迫切需要深入研究动脉粥样硬化钙化的影响因素和潜在机制，以制定ASCVD的预防和治疗策略。许多危险因素已被证明促进冠脉钙化的发生和发展，其中大部分与ASCVD有关，尤其是脂质相关指标。然而，一些考察Lp（a）与冠脉钙化相关性方面的较小样本量研究得出矛盾结果。综上，Lp（a）水平升高是否与冠脉钙化相关仍不清楚，其与血管钙化关系的潜在机制尚待研究。
在此背景下，中国医学科学院阜外医院李建军教授团队迎难而上，开展了一项基于人群的体外分析，分析了2806例疑似CAD患者的冠脉钙化水平，并检验了Lp（a）刺激人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）血管钙化的假设，得出了创新性结果。这项研究近期发表在Metabolism: Clinical and Experimental杂志。
研究方法
2012年5月至2018年4月，共7358例心绞痛样胸痛且疑似CAD的患者被连续纳入本研究。排除不符合条件者后，共2806例受试者纳入最终分析。研究者收集了所有受试者的基线特征，包括人口统计学数据、生活方式特征、病史和入院前的药物使用情况。入院后空腹至少12小时后，通过肘静脉采集血样。采用免疫比浊法测定Lp（a）水平，<30 mg/dL定义为正常。
冠脉钙化的存在和严重程度可通过冠脉CT检测。本研究采用64层CT评估冠脉钙化。采用Agatston法计算CACS，CACS>0判定为存在冠脉钙化。根据 0、0.1-100和>100的评分范围，分成钙化严重程度增加的3组。为评估人血浆Notch1和骨桥蛋白（OPN）水平与冠脉钙化的潜在关联，随机选择57例钙化患者和57例年龄、性别匹配的无钙化患者作为对照，采用市售ELISA试剂盒测量循环Notch1和OPN水平。
采购的HASMCs在生长培养基中按常规条件培养。采购的Lp（a）经FDA批准的试验显示对HBsAg、抗HCV、抗Hbc无反应，抗HIV 1和2呈阴性。将HASMCs在钙化培养基中培养以诱导矿物质化。为评估Lp（a）对血管钙化的影响，在钙化介质的存在下，用不同浓度的Lp（a）处理HASMCs 7-14天。处理14天后，使用von Kossa染色法（钙盐染色试剂盒）检测到HASMCs的钙化沉积。处理48小时后使用FLIPR钙6检测试剂盒测定细胞质钙离子浓度；使用荧光显微镜进行钙成像。在处理期末期（3或7天）使用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶（ALP）显色试剂盒检测细胞内ALP活性。此外，使用ALP检测试剂盒分析细胞培养上清液中的ALP活性水平。
免疫荧光分析方面，处理24 h后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗HASMCs并固定30 min。细胞核染色后进行保护，最后在共聚焦显微镜下拍照。小干扰RNA转染方面，HASMCs在无抗生素生长培养基中培养至70%-80%融合，后与人NF-κB p65特异性siRNA（80nM）和RNAiMAX在无抗生素、无血清培养基中的混合物孵育24小时。用Lp（a）刺激HASMCs 24小时，以干扰siRNA作为阴性对照。使用市售ELISA试剂盒测定HASMCs产生的炎性细胞因子白细胞介素-1β（IL-β）和白细胞介素-6（AL-6）水平。
数据统计方面，使用单变量和多变量逻辑回归分析计算冠脉钙化的OR和95% CI。多变量模型对年龄、性别、收缩压（SBP）、高血压、总胆固醇（TC）、LDL-C、载脂蛋白B（apoB）、Lp（a）、高敏C反应蛋白（hs-CRP）、D-二聚体和他汀治疗等变量进行控制。根据CACS，应用单变量和多变量线性回归分析评估冠脉钙化严重程度的独立危险因素。多变量线性回归模型根据上述变量进行校正。对于体外研究，进行单向方差分析或t检验以确认组间差异。
研究结果
人体Lp（a）水平与冠脉钙化的存在和严重程度呈正相关
根据冠脉钙化分层的受试者基线特征如表1。全部人群中Lp（a）水平分布偏斜，四分位Lp（a）5.79-30.61mg/dL，中位12.78 mg/dL。总的来说，581例（20.7%）冠脉钙化患者的血浆Lp（a）水平高于无钙化者（P<0.05，表1）。同样，CACS>100者Lp（a）水平高于CACS = 0或位于0.1-100范围者（均P<0.05）。根据Lp（a）水平将受试者分为<10 mg/dL（低）、10-30 mg/dL（中）和>30mg/dL（高）3个亚组。高、中Lp（a）水平者的CACS显著高于低Lp（a）水平者（均P<0.05）。还观察到，与低Lp（a）组相比，高Lp（a）组中冠脉钙化程度高的比例更高（P<0.05）。值得注意的是，冠脉钙化者的hs-CRP水平高于非钙化患者（P=0.003，表1）。如图1所示，Lp（a）水平每增加1-SD，与冠脉钙化风险增加11.0%显著相关（OR=1.110，95% CI：1.013-1.217，P=0.025）。此外，校正混杂因素后，Lp（a）水平仍与CACS显著正相关（β=0.132，P<0.001）。
表1.基线特征
图1. 危险因素与冠脉钙化的关系
Lp（a）诱导HASMCs血管钙化
为评估Lp（a）在体外血管钙化中的作用，研究者将HASMCs在正常生长培养基或钙化介质存在下与不同浓度（0、2.5和5 μg/mL）的Lp（a）孵育。蛋白印迹分析显示，Lp（a）诱导正常培养基中HASMCs的促钙化蛋白水平增加，包括骨形态发生蛋白2（BMP2）和OPN。诱导血管钙化的最佳条件是5 μg/mL的Lp（a）刺激24小时（图2A和B）。正常培养基中经Lp（a）处理的HASMCs经von kossa染色未检测到矿化钙沉积。然而，在钙化介质存在下，HASMCs与不同浓度的Lp（a）孵育14天后，观察到Lp（a）剂量依赖式增强HASMCs的钙化（图2C）。类似地，ALP活性染色显示，Lp（a）诱导在钙化介质中培养7天的HASMCs中ALP活性也呈剂量依赖式增加（图2D）。此外，与仅在钙化介质下培养相比，4和7天后，含有5 μg/mL Lp（a）的HASMCs培养上清液中ALP活性显著更高（P<0.05，图2E）。
图2.Lp (a)对HASMC钙化的影响
Lp（a）上调血管钙化中Notch1信号
Notch1信号通路参与血管平滑肌细胞的成骨分化。此外，我们的临床数据显示，冠脉钙化患者的Notch1水平高于非钙化患者。因此，我们使用DAPT作为特异性抑制剂，检测了Notch1信号通路激活在Lp（a）诱导的血管钙化中的作用。Western bolt分析显示，与单用Lp（a）处理相比，用5 μg/mL Lp（a）和20μM的DAPT孵育的HASMCs中，BMP2和OPN水平显著降低（P<0.05，图3A）。此外，与单用Lp（a）处理相比，DAPT减少了Lp（a）诱导的HASMCs内ALP活性的增加，并降低培养上清液中ALP活性水平39.0%（P<0.05，图3B）。
此外，钙水平测定显示Lp（a）诱导的HASMCs中钙荧光信号显著增加（图3C），而DAPT抑制Lp（a）诱导的HASMCs中钙荧光的表达（P<0.05）。即，由Lp（a）诱导的血管钙化被DAPT显著抑制。Notch1在人动脉粥样硬化病变的VSMCs中高度表达，并介导血管损伤后VSMCs的增殖、迁移和新内膜形成。因此接下来研究了Lp（a）诱导的HASMCs中Notch1信号相关蛋白的表达。蛋白印迹分析显示，在Lp（a）刺激下，被DAPT抑制的Notch1、Jagged1、RBP-Jk和Hes1信号出现上调（图3D）。总之，上述结果表明Notch1信号在Lp（a）诱导的HASMCs中促钙化反应中起重要作用。
图3. Lp（a）对血管钙化Notch1信号的调节
Notch1信号激活Lp（a）诱导的血管钙化中的BMP2-Smad1/5/9信号
BMP2-Smad1/5/9信号通路是体内外促进成骨细胞分化的经典途径，因此接下来研究了BMP2-Smad1/5/9信号在Lp（a）诱导的细胞钙化中的作用。评估了用5 μg/mL Lp（a）处理0-12小时的HASMCs中Smad1/5/9的激活。蛋白印迹分析显示，Smad1/5/9磷酸化水平在15分钟后开始上升，并在1小时后达到峰值（图4A）。为进一步阐明BMP2-Smad1/5/9信号在介导Lp（a）诱导的血管钙化中的作用，在Lp（a）刺激前用BMP2抑制剂Noggin蛋白预处理HASMCs，Noggin蛋白通过结合BMP2限制成骨细胞分化。首先将400 ng/mL Noggin蛋白定义为抑制Lp（a）处理的HASMCs中BMP2表达的最佳浓度（图4B）。
如图4C所示，在Lp（a）处理的HASMCs中，Noggin蛋白显著下调BMP2信号蛋白的表达，包括BMPR1A、Smad1/5/9磷酸化和DNA结合蛋白抑制剂（ID-1）。然而，Noggin蛋白对Lp（a）刺激的HASMCs中OPN的表达无影响。Noggin蛋白预处理显著减弱了Lp（a）诱导的HASMCs培养上清液中细胞内ALP活性染色和ALP活性水平的增加（图4D）。此外，FLIPR钙6分析表明，Noggin蛋白预处理降低了Lp（a）在HASMCs中诱导的细胞内钙水平（图4E）。
上述发现表明，Lp（a）激活了血管钙化中的BMP2-Smad1/5/9信号。如图3A所示，DAPT对Notch1信号传导的抑制显著减弱了Lp（a）诱导的HASMCs中BMP2蛋白表达的上调。类似地，DAPT减弱了Lp（a）诱导的HASMCs中BMPR1A、Smad1/5/9磷酸化和ID-1蛋白表达的增加（图4F）。这些观察表明，在Lp（a）诱导的血管钙化中，Notch1信号激活BMP2-Smad1/5/9信号。
图4. 在血管钙化过程中Lp (a)激活Notch1-BMP2-Smad1/5/9信号通路
Notch1信号激活NF-κB信号，上调Lp（a）诱导的血管钙化中OPN表达
先前研究表明，NF-κB参与成骨细胞的分化和功能。因此接下来研究了NF-κB信号在Lp（a）诱导的血管钙化中的作用。检测了5 μg/mL Lp（a）处理0-12小时后HASMCs中磷酸化NF-κB的表达，Western blot分析表明，磷酸化NF-κB表达在Lp（a）刺激后1和6小时维持高水平，1小时后检测到最高表达（图5A）。为进一步确定NF-κB信号与Lp（a）诱导的血管钙化间的关系，在Lp（a）刺激HASMCs之前，用NF-κB特异性小干扰RNA（siNF-κB）孵育HASMCs。NF-κB沉默显著降低了Lp（a）诱导的HASMCs培养上清液中细胞内ALP活性染色和ALP活性水平的增加（图5B）。FLIPR钙6测定也显示NF-κB沉默显著降低了Lp（a）刺激的细胞内钙水平升高（图5C）。
值得注意的是，蛋白印迹分析显示NF-κB沉默抑制了Lp（a）诱导的HASMCs中OPN的表达，而对BMP2水平没有影响（图5D）。对NF-κB信号下游的炎性细胞因子表达的分析表明，在Lp（a）处理的细胞中，IL-1β和IL-6的水平显著增强，这与临床结果一致。与单用Lp（a）处理的HASMCs相比，用siNF-κB预处理的HASMCs中的IL-1β和IL-6水平降低（均P<0.05，图5E）。鉴于Notch1已被证明在血管钙化中激活NF-κB信号，进一步评估了Notch1信号在Lp（a）处理的HASMCs中调节NF-κB信号的作用。1小时后，Lp（a）诱导的NF-κB磷酸化增加被Notch1抑制剂DAPT消除（图5F）。
此外，免疫荧光染色显示Lp（a）增强NF-κB亚单位p65的表达，并促进p65转位到HASMCs的细胞核中（图5G），表明Notch1信号调节Lp（a）诱导的血管钙化中的NF-κB信号。类似地，DAPT预处理显著降低了Lp（a）刺激的IL-1β和IL-6的表达（均P<0.05，图5H）。因此，在HASMCs钙化中，Notch1信号通过NF-κB信号调节OPN的表达，在Lp（a）诱导的血管钙化中，Notch1信号和NF-κB信号呈正相关。
图5. Lp (a)通过Notch1-NF-κB信号通路诱导HASMC钙化
年龄、性别匹配的冠脉钙化患者，血浆Notch1、OPN水平较高
为进一步阐明钙化相关蛋白的表达，分析了随机选择的57例冠脉钙化患者和57例年龄和性别匹配的阴性对照组血浆Notch1和OPN水平。四分位Notch1水平范围为175.86-286.15ng/dL，中位217.43ng/dL。OPN平均水平为14.41±4.40 ng/mL。与对照组相比，冠脉钙化者的血浆Notch1（241.78 vs. 194.71 ng/dL，P=0.028，图6）和OPN（15.41 vs. 13.41 ng/mL，P=0.008，图6A和B）。此外，在校正多个混杂因素后，Notch1和OPN水平与CACS显著正相关（β=0.195，P=0.021；β=0.175，P=0.045，图6C和D）。
图6 .CACS与患者血浆Notch1、OPN水平的关系
研究结论
分析数据显示，在疑似CAD患者中，Lp（a）水平升高与冠脉钙化的存在和严重程度独立相关。尤其重要的是，体外研究结果显示，Lp（a）通过调节Notch1信号与NF-κB和BMP2-Smad1/5/9信号通路的相互作用，促进血管钙化（图7）。我们的结果具有创新性，并为Lp（a）在血管钙化中的作用提供了更深入的理解。此外，研究结果提示降Lp（a）具有治疗血管钙化的潜力。
图7. Lp (a)与血管钙化的相关性
来源：Jianjun Li et al. Lipoprotein (a)-mediated vascular calcification: population-based and in vitro studies. Metabolism. 2022 Feb;127:154960. doi: 10.1016/j.metabol.2021.154960.
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