刘文能 成都市第一人民医院
王天杰 杨跃进 中国医学科学院阜外心血管病医院
Asahara等于1997年成功地从人外周血中分离出EPC，自此揭开了EPC血管再生功能研究的序幕。EPC起源于骨髓，可以被肿瘤、外伤和缺血发生时分泌的各种细胞因子动员到外周血中。除了骨髓和外周血，从脐带血、胎肝和骨骼肌中都已成功地分离出EPC。传统观念认为，EPC主要参与胚胎发生时期的血管生成，而最新的研究发现EPC也参与成年人的血管再生，主要有两种方式：血管发生（vasculogenesis） 和血管生成（angiogenesis）。前者是指EPC参与生成整段新生血管，后者则是在残存血管基础上芽生出新的血管。EPC数目非常少，在成人外周血中更加稀少，只占总细胞数0.01%，可能与成熟内皮细胞更新率低有关。本文将对EPC在多种疾病中的作用和其潜在的临床应用做一阐述。
EPC起源、表型和分类
EPC起源于胚胎发生时期卵黄囊血岛，同多能造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells，HSCs）有共同起源，均表达CD31/CD34/VE-cad/Tie-2。出生后，骨髓中的EPC在各种病理生理因素的刺激下可以动员到外周血中，成为循环EPC。循环EPC可以在已有血管基础上扩展毛细血管网或者参与生成新生血管。
关于EPC的表型一直存在争议，通常认为EPC同时表达HSC和成熟内皮细胞的标志物（表1）。已有的研究认为EPC可以表达Flk-1，vWF，VE-cad，CD31，Tie-2/TEK，Tie-1，c-Kit，CD34，CD133，Sca-1和Flt-1。
EPC在特异性内皮培养基中能够增殖形成集落形成单位（Colony-forming Units，CFU），能够吞噬Ac-LDL和结合UEA-1，具有形成管腔和定向迁移能力。因此许多研究通过以上功能学特征来鉴别EPC。
由于外周血和骨髓中的EPC比例和数目很低，目前主要通过细胞培养扩增获得EPC。常用的分离培养EPC的方法是利用磁珠或者流式细胞仪分选CD133阳性的细胞，再进行培养。另一种方法是将骨髓和外周血的单个核细胞接种到纤维连接蛋白包被的培养皿上，通过特异的内皮培养基进行培养，培养5~7天后，可见纺锤形或者梭形细胞。EPC经过持续培养后抗原表型会发生变化，因此需要联合细胞表面标志物和功能学方法来鉴定培养的EPC。
人外周血单个核细胞持续培养可以得到两类EPC，早期EPC和晚期EPC。这两类细胞有共同的表型（CD31、vWF和VEGFR-2），但细胞形态、生长方式和增殖能力不同。早期EPC出现在接种后5~7天，呈纺锤形，而晚期EPC出现较晚，培养12~21天才会出现，呈铺路石样（二者比较见表1）。Mukai等将外周血培养得到的早期EPC和脐带血来源的晚期EPC移植到血管闭塞处，发现晚期EPC可以形成新生血管，而早期EPC则不能，结论认为晚期EPC更适合用来帮助血管新生。
不过目前缺少EPC鉴定的标准方法，培养方法也不统一，对EPC特异性表型和分离培养真正有功能的EPC亚群都有待进一步明确。目前研究推荐将VEGFR-2，CD34，c-Kit和CD133作为人EPC标志物，而将VEGFR-2，Sca-1，c-Kit和CD133作为鼠EPC标志物。此外，研究者还建议检测EPC向早期内皮细胞分化时表达的标志物，例如CD31和vWF，以及EPC在血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor， VEGF）和基质细胞衍生因子（Stromal cell Derived Factor，SDF-1）等趋化因子作用下的迁移能力。
EPC动员机制
EPC可以被多种细胞因子动员，包括VEGF，GM-CSF，SDF-1，和Epo等。组织损伤和缺血缺氧时，可以上调缺氧诱导因子-1α表达（HIF-1α），HIF-1α又可以上调VEGF和SDF-1的表达以促进EPC动员。VEGF导致内皮细胞和成骨细胞eNOS磷酸化和激活，eNOS可以上调骨髓NO水平，有利于EPC从骨髓释放到外周血中。eNOS在维持骨髓微环境尤其是调节VEGF诱导的EPC动员中发挥重要作用。
进入外周血的EPC在损伤组织释放的诱导因子，如SDF-1作用下，归巢到损伤处促进损伤修复。除了参与血管再生，EPC也可以通过旁分泌促进损伤组织再生，减少炎症反应和促进细胞存活和增殖。
促红细胞生成素（EPO）能够促进成熟内皮细胞增殖和迁移，有研究利用EPO促进肢体缺血鼠的HSC增殖和EPC骨髓动员，发现EPO治疗后外周血早期EPC数目增加。
糖尿病患者EPC动员障碍，成血管能力也下降。通过高压氧疗提高血氧浓度可以提高骨髓NO水平，逆转EPC动员障碍。外源性SDF-1联合高压氧疗可以协同增加链脲霉素（STZ）诱导的糖尿病鼠EPC数目，促进EPC归巢。
EPC移植的应用
EPC可以分化为内皮细胞，参与血管发生和血管生成。目前对EPC的独立生成血管能力尚存争议，在血管发生过程中EPC可能需要内皮细胞和血管周围细胞协同发挥作用。研究发现将血管周围细胞和培养的EPC共同移植可以在体内生成血管网。而将外周血或者脐带血来源的EPC单独移植也能够生成血管，但效果不如联合移植显著，且新生血管易退化。
利用EPC移植促进血管新生提供了一种治疗血管病变的新途径。许多研究证实移植的EPC能够促进组织血管再生，损伤发生时EPC成血管作用也相应增强。
获得健康的EPC对移植治疗十分重要，糖尿病、动脉粥样硬化或者阿尔茨海默病患者的EPC功能都不同程度受损。常用的改良方法是转染VEGF和SDF-1基因。研究发现转染编码HMG-CoA还原酶抑制剂的基因可以增加鼠角膜损伤模型的循环EPC的数目，而eNOS可以抑制内膜增生，促进再内皮化，以上都可作为改良EPC的靶点。
EPC也可以增加组织工程学中血管移植物的生物学兼容性。研究发现将移植血管用CD34阳性细胞包被后再植至犬胸主动脉能促进移植物内皮化。还有研究利用G-CSF促进白细胞（包括CD34+细胞）迁移和移植物内皮化。由于缺乏和正常组织的连接血管，移植的胰岛存活率不高，而移植EPC则可以提高胰岛移植后的成功率。
EPC和非肿瘤性疾病
在糖尿病、心肌缺血等许多病理状态下，EPC数目下降和功能减低，导致血管损伤和修复失衡，从而使患者的血管新生能力减低。
心肌梗死
已经有研究在裸鼠心肌梗死模型上证实移植人外周血EPC可以通过促进血管新生和抑制围梗死区肥厚心肌细胞凋亡来减少左室重构，并提高心功能。
Kawamato等第一次将自体EPC（CD31阳性单个核细胞）移植到猪慢性心肌缺血模型中，成功缩小了梗死面积并改善了左室功能。临床自体移植实验TOPCARE-AMI（the Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction）将急性心肌梗死患者自体EPC经冠状动脉灌注输入到梗死区。4个月和1年随访都取得了理想的结果，左室射血分数、左室收缩末期容积、梗死区局部室壁运动等指标都有明显改善。
FIRSTLINE-AMI实验对AMI患者PCI术后皮下注射G-CSF以动员骨髓CD34阳性细胞，术后4个月随访发现CD34阳性细胞数目增加，并且左室收缩末期容积、射血分数同对照组相比都有改善。不过类似的临床试验REVIVAL-2应用G-CSF后并未返现左室功能改善。
肺动脉高压
肺动脉高压患者内皮功能严重受损，NO合成减少。在野百合碱（MCT）诱导的肺动脉高压模型中，自体移植的EPC能够改善病变程度。Nagaya等将转染了肾上腺髓质素基因的人脐带血EPC移植到MCT处理的大鼠，肺动脉高压也显著改善，单纯EPC组肺血管阻力下降了16%，而转染组肺血管阻力下降了39%。
基于以上EPC基因改良实验的良好效果，2006年首个针对新生儿肺动脉高压的基因结合细胞治疗的临床试验——PHACeT（the Pulmonary Hypertension Assessment of Cell Therapy）开展了II期临床试验。试验利用肺动脉高压患者自体外周血来源的EPC，转染eNOS基因后再输回肺部以重建肺血管内皮功能，结果令人期待。
糖尿病
糖尿病患者循环EPC数目和功能都下降，动物实验发现骨髓移植可以促进STZ导致的糖尿病小鼠的胰岛血管再生和促进β细胞增殖。Hess等人发现血管内输注骨髓细胞到STZ诱导的糖尿病小鼠5天后血糖水平开始下降，7天后胰岛素水平恢复至接近正常，研究认为骨髓中的EPC通过分化成为内皮细胞促进损伤的胰岛的再血管化。
肝脏再生和修复
Fujii等将骨髓细胞转染绿色荧光蛋白基因后进行移植，发现肝脏损伤后，局部绿色荧光蛋白阳性细胞增加，主要为表达CD31的肝窦内皮细胞。在二甲基亚砜和四氯化碳所致的肝脏损伤模型中，应用外周血和骨髓的EPC可以抑制肝脏纤维化，并且促进肝细胞存活。研究认为EPC主要通过迁移至肝窦并分泌EGF，HGF，TGF-α和VEGF等生长因子来促进肝脏细胞增殖。
Yannaki等对两项晚期肝硬化患者进行G-CSF三期治疗，发现CD34阳性细胞增加并伴随血清VEGF水平上升，提示EPC对肝脏修复可能有帮助。
EPC帮助判断疾病的风险
动脉粥样硬化、糖尿病和阿尔茨海默病等患者均有内皮功能受损，EPC数目和迁移能力及成血管功能也下降，对疾病的临床预后造成影响。例如正常情况下骨髓EPC可以被eNOS动员，但在糖尿病患者中，此动员机制受损，EPC不能充分动员以修复损伤的胰岛细胞。
非糖尿病患者的EPC